La Cromatografía

En esta página encontrarás apuntes desde de los conceptos básicos de una cromatografía, porqué es importante y quien lo inventó hasta fundamentos más complejos sobre como se separan las muestras y el registro cromatográfico. Para convertirte en un experto en la materia te animamos que te quedes hasta el final.

¿Qué es una Cromatografía?

Respuesta corta: Una cromatografía es una técnica de separación que se basa en la afinidad que tienen las sustancias a separar con las fases implicadas en el proceso.

Respuesta larga: La cromatografía es una técnica analítica que permite separar una mezcla de solutos, a los que llamamos analitos, dentro de una muestra compleja, se separan por la diferencia de velocidad de desplazamiento de los mismos al ser arrastrados por una fase móvil a través de una fase estacionaria.

¿Qué conceptos son importantes en cromatografía?

Antes de seguir, es necesario que aclaremos algunos conceptos que hemos utilizado o vamos a utilizar más adelante:

Analitos: Son las sustancias de interés que componen la muestra a analizar. 

Fase estacionaria: Como su nombre indica, es la parte del sistema cromatográfico que permanece inmóvil durante el proceso. Puede estar constituida por un sólido, un gel o un líquido, aunque para este último caso es muy habitual que esté sobre un sólido que no interactúa.

Fase móvil: Es el fluido que penetra por la fase estacionaria con una dirección fija, puede ser un líquido o un gas.

Lecho cromatográfico: Es la parte interior de la fase estacionaria y con la que los analitos interaccionan.

Velocidad de elución: Es la velocidad con la que se desplazan los analitos a través de la fase estacionaria.

Cromatograma: Representación gráfica de los resultados de la cromatografía.

Tiempo muerto: Tiempo que tarda en salir un componente de la muestra que no se ha quedado retenido en ningún momento por la fase estacionaria (o la propia fase móvil).

Tiempo de retención: tiempo medio que tarda en salir un componente.

¿Cómo funciona una cromatografía?

El fundamento de una cromatografía se basa en la interacción de los analitos con las dos fases del sistema (móvil y estacionaria). Esto sucede en función de la afinidad que tenga cada analito de la muestra con cada una de las fases. Tardarán más o menos en recorrer toda la columna en función de si un analito tiene mucha afinidad por la fase móvil, que saldrá antes de la columna, o si por el contrario va quedando retenido por la fase estacionaria, esta diferencia de afinidad es lo que provoca que los analitos se separen.

La relación entre lo que se queda retenido en la fase estacionaria y lo que se eluye con la fase móvil se conoce como coeficiente de reparto (K_d) y se puede calcular así:

¿Quién inventó la cromatografía?

La primera persona en dejar registros del uso de esta técnica fue Mikhail S. Tsvet, botánico de origen ruso, en 1906. Tsvet la usó para la separación de pigmentos naturales de plantas y le dio este nombre a la técnica ya que la composición de palabras que la forman, de origen griego, significan “escritura de colores”. (Como curiosidad: este nombre, aún se duda si realmente el ruso quiso llamar a la técnica “escritura de Tsvet” ya que su nombre, en ruso, significa color.)

Para estos primeros pasos de la cromatografía Tsvet empaquetó material absorbente en una columna de vidrio y la colocó en posición vertical.

Después, vertió por la parte de arriba la combinación de diferentes pigmentos y observó cómo, a medida que bajaban por la  columna, se iban repartiendo a lo largo del recorrido quedando los colores de los pigmentos totalmente separados.

¿Por qué es importante la cromatografía?

La cromatografía es una de las técnicas más utilizadas en la química analítica, existen numerosos estudios que han sido posibles gracias a esta técnica ya que aporta una gran versatilidad y es capaz de separar cualquier mezcla de analitos solubles o volátiles si utilizamos las condiciones adecuadas.

Esta técnica mejora propiedades analíticas como la sensibilidad (permite detectar un analito en la muestra a concentraciones más bajas) y selectividad (elimina las interferencias que pueda haber en la matriz de la muestra).

La finalidad de aplicar una técnica cromatográfica puede ser 2:

• Analítica: Se separan y después determinamos los componentes de una muestra.
• Preparativa: Donde se separa uno o varios componentes para una utilización posterior.

¿Cómo se separan los componentes de la muestra?

Cuando se diseña un sistema cromatográfico, hay que tener en cuenta los aspectos termodinámicos y cinéticos de cada uno de los analitos dentro de la muestra para conseguir separarlos. El primer aspecto, termodinámico, marcará la velocidad con la que el analito saldrá del sistema (es decir, en qué tiempo podremos ver reflejado un pico en el cromatograma) y el segundo, cinético, cuánto tardará en hacerlo (lo ancho que será ese pico).

Cuando añadimos un analito a la fase móvil que no interacciona con la fase estacionaria, este se mueve exactamente a la misma velocidad que lo está haciendo la fase móvil, es decir el pico que formaría en el cromatograma  aparecería cuando hubiera salido el volumen de fase móvil correspondiente al volumen total que deja vacío el lecho estacionario (volumen muerto).

Sin embargo, como los analitos de la muestra sí interaccionan con la fase estacionaria, se necesita que se aporte más volumen de fase móvil para poder sacarlos de la columna (Volumen de retención).

Como el caudal de un sistema cromatográfico es constante, en cromatografía se suele hablar en términos de tiempo (que para este caso es equivalente), es decir; Tiempo Muerto (t_M) y Tiempo de Retención (t_R).

En función a esto, se nos podrá presentar distintos tipos de desarrollos de la muestra en el sistema y el cromatograma que obtendremos será distinto.

¿Cómo se realiza una cromatografía?

En cromatografía se considera desarrollo a como van avanzando los analitos a través del lecho cromatográfico. En función de cómo lo hagan tenemos:

Desarrollo por elución: Es el tipo de desarrollo más común en cromatografía, en él la fase móvil se está dosificando continuamente y se inyecta una pequeña cantidad de muestra en la corriente. Los analitos se separan totalmente en función de su afinidad con cada una de las fases:

Desarrollo frontal: En este tipo de desarrollo la muestra fluye de manera constante, haciendo también de fase móvil. El componente de esta muestra que tiene menos afinidad por la fase estacionaria recorre el lecho cromatográfico más rápidamente, mientras los que tienen una mayor afinidad quedan retenidos al inicio del lecho. Cuando el lecho cromatográfico llega al límite de analito que puede retener, el exceso de este empieza a fluir a través de él. Este tipo de desarrollo normalmente es usado como técnica preparatoria.

Desarrollo por desplazamiento: Con este tipo de desarrollo lo que se hace es preparar una fase móvil tenga mucha afinidad por la fase estacionaria (más que la muestra), es decir, una vez introducida en el lecho cromatográfico, esta fase móvil separa al analito retenido por la fase estacionaria y colocándose ella en su lugar.

Esto da lugar a que parte de los analitos que tienen menos afinidad por la fase estacionaria se recupere de forma pura, después se recupere una mezcla de los analitos de la muestra y por último se recupere el analito que se retenía más fuertemente de forma pura.

¿Qué es un cromatograma?

Un cromatograma o registro cromatográfico es la representación gráfica de la cromatografía. En esta gráfica que representa en el eje Y la señal del analito detectado, que se relaciona directamente con la concentración de este, y en el X el tiempo transcurrido.

Con esta representación podemos obtener información acerca de la complejidad de la muestra, la cantidad cuantitativa, cualitativa y sobre cómo está funcionando el sistema. También nos permite identificar el analito a partir del tiempo de retención o la señal que da.

Por ejemplo, si en un cromatograma aparecen picos con dos puntas, o uniformes por una de las pendientes, quiere decir que dos o más analitos están saliendo del lecho al mismo tiempo y podríamos solucionarlo, por ejemplo, bajando el caudal con el que entra la fase móvil al sistema cromatográfico.

También podemos solucionar otro tipo de problemas en el sistema observando el cromatograma, por ejemplo, cuando uno de los picos no es totalmente simétrico puede deberse a diversos factores, entre ellos: 

• La columna está deteriorada.
• Hay un componente en la columna que retenga fuertemente la muestra.
• La columna está sobrecargada con demasiada cantidad de muestra.
• El disolvente de la muestra es demasiado fuerte para la fase móvil.
• Ensanchamiento debido a factores externos de la columna.
• Hay un control de pH inadecuado.
• Fase móvil no no entra con la temperatura adecuada.

¿Qué tipo de cromatografías existen?

Los tipos de cromatografías se pueden clasificar en función de distintos criterios como de acuerdo con la forma del lecho cromatográfico o de acuerdo al estado de la fase móvil.

Clasificación por forma del lecho cromatográfico

Cromatografía en columna: El lecho estacionario está dentro de un tubo, que puede estar de diferentes formas, ya bien cubriendo todo el interior del tubo (Columna empaquetada) o dejando un paso por el centro de la fase estacionaria (Columna tubular abierta).

Cromatografía plana: En este tipo de cromatografía el lecho cromatográfico está sobre un plano. Los materiales que lo construyen normalmente son de papel o de papel impregnado en una sustancia que haga las veces de fase móvil (Se conoce como cromatografía en papel). También puede ser una capa sólida o gel extendida en un soporte de vidrio (Se conoce como cromatografía en capa fina).

Clasificación en función de el estado de la fase móvil

En función del estado de la fase móvil nos podemos encontrar:

Cromatografía de gases (GC): En esta modalidad la fase móvil es un gas, siempre se desarrolla en una columna.

Cromatografía líquida (LC): La fase móvil es un líquido, puede desarrollarse en columna o sobre un plano.

También se pueden clasificar en función del estado físico de las dos fases del sistema, donde siempre se nombra primero el estado de la fase móvil. De este modo podríamos encontrarnos con:

• Cromatografía gas-líquido.
• Cromatografía gas-sólido.
• Cromatografía líquido-líquido.
• Cromatografía líquido-sólido.

Para elegir correctamente el tipo de cromatografía que tenemos que usar en cada caso, debemos tener en cuenta:

• Analitos y concentraciones.
• Naturaleza y cantidad de muestra.
• Objetivo de la separación.
• Tiempo del que se disponga.
• Disponibilidad de equipo e instrumentos.