¿Qué es y cómo funciona un HPLC?

En esta página encontrarás todos los apuntes necesarios para dominar qué es y cómo funciona un HPLC, nos centramos en cada una de sus partes y se explican sus modos de funcionamiento.

Antes de seguir: Si no tienes nociones básicas sobre este instrumento, te recomendamos que eches un vistazo a nuestra publicación sobre cromatografía, donde se recogen los conceptos básicos que vamos a utilizar en esta publicación.




¿Qué es un HPLC?

En química, HPLC son las siglas de High-performance liquid chromatography, es decir, cromatografía líquida de alto rendimiento.

Es una modalidad de cromatografía se realiza en columna, donde los analitos son inyectados en una corriente de fase móvil que va impulsada por una bomba la cual aporta una presión al sistema relativamente alta. Se usa para partículas con peso molecular inferior a 2000.

Es la técnica de separación más empleada en química analítica y se usa tanto para saber si existe un analito en la muestra como para cuantificar la cantidad de este. Que sea una técnica tan popular se debe a que es relativamente sencillo adaptarla a la separación que se quiera llevar a cabo y que se puede aplicar a gran cantidad de estudios científicos e industriales de gran interés.

¿Quién inventó el HPLC?

La primera publicación de algo parecido a un HPLC fue a mediados de los años 60s, donde investigadores de la Universidad de Yale (New Haven, EEUU) publicaron un estudio donde se utilizó una bomba para acelerar el flujo de la fase móvil a través de la columna. 

A principios de los 70s, la empresa Waters Associates, fundada por Jim Waters, empezó a comercializar las primeras versiones de HPLCs. Estos instrumentos tuvieron una gran aceptación, ya que mejoró los tiempos de análisis de la cromatografía líquida notablemente, debido a la incorporación de una bomba de alta presión que hacía que la fase móvil se moviera a una velocidad mucho más alta a lo que, por aquella época, era habitual.




¿Cómo funciona un HPLC?

Aunque en apartados posteriores nos vamos a centrar en cada uno de los componentes de este tipo de cromatografía, el funcionamiento de un HPLC de manera simplificada se basa en que una bomba de tipo pistón empuja la fase móvil desde el depósito hasta el detector, pasando por todos los componentes del circuito. En un punto de este circuito (antes de llegar a la columna) se inyecta una pequeña cantidad de muestra a través de un inyector, esta muestra separa los analitos que la componen en la columna. Finalmente, el detector manda la señal a un dispositivo de recopilación de datos (un ordenador correctamente configurado).

En el siguiente esquema se muestra el funcionamiento del HPLC arriba resumido:

Para detallar el funcionamiento de un sistema de este tipo tenemos que detenernos en cada una de las partes por separado:

Depósito de fase móvil

En este depósito es donde se almacena la fase móvil. La fase móvil de este sistema puede ser suministrada desde un sólo depósito o desde varios si esta es mezcla de varios componentes.

Un sistema HPLC, es un sistema muy sensible, esto hace que tenga muchas ventajas y versatilidad a la hora de analizar los componentes de una muestra, pero por otro lado, tiene el inconveniente que cualquier interferencia o contaminación alterará los resultados del análisis. Para evitar este tipo de contaminación, se debe tener en cuenta diferentes factores a la hora de preparar el depósito de la fase móvil.

Lo primero que se debe hacer antes de poner el depósito en el sistema cromatográfico, es asegurarnos que la fase móvil no presenta burbujas en su interior, esto se hace en la fase conocida como desgasificación de fase móvil.

Para este fin, existen diversas técnicas, entre las más comunes son:

  • Sonicación: Consiste en meter el depósito que contiene la fase móvil en un baño de ultrasonidos, esto hace que las burbujas que están disueltas se rompan, suban a la superficie y se eliminen de la fase móvil. Aunque es el método más utilizado, a veces es complicado saber cuando la fase está totalmente desgasificada ya que esto depende del tiempo que el depósito ha estado en el baño.
  • Helio Sparging: Con este método lo que se hace es burbujear helio a través de la fase móvil, haciendo que el helio desplace las burbujas hacia la superficie. Este método es muy efectivo pero más caro que el anterior ya que requiere la adquisición periódica de cilindros de helio.

Una vez que los depósitos de la fase móvil han sido desgasificados, hay que asegurarse que esta no se contamine por la acción de agentes externos, para evitar meter al sistema interferencias o atascar el sistema. Para solucionar este problema se dispone de dos piezas claves que se deben añadir al depósito de la fase móvil: El tapón perforado y el filtro.

  • Tapón perforado: Evita que partículas externas (polvo, humedad, etc…) entren al depósito de la fase móvil y, por tanto, al sistema. 
  • Filtro de entrada: Esta pieza es indispensable, evita que partículas externas que se encuentren en la fase móvil entren al sistema y causen problemas de obstrucción. 

Además de tener estas dos piezas incorporadas en el depósito para evitar que partículas indeseables, es muy importante que las fases móviles también estén filtradas para evitar que el filtro se obstruya. 




Bomba de impulsión

La bomba de impulsión en un sistema HPLC es la encargada de hacer que el fluido pase por todo el circuito cromatográfico, esta es de tipo pistón y su esquema de funcionamiento sería como se muestra en la siguiente imagen: 

Las partes más importantes en esta bomba son las que se muestran en la figura: el pistón mencionado anteriormente, dos válvulas de tipo bola que funcionan con posiciones opuestas (cuando una está abierta la otra estará cerrada y viceversa) y la junta de cierre del pistón.

Esta bomba tiene dos posiciones, aspiración e impulsión, en la fase de aspiración, el pistón sube, la válvula de entrada se abre y la válvula de la zona de salida se cierra, haciendo que sólo pueda entrar la fase móvil en la bomba. En la fase de impulsión sucede lo contrario, el pistón baja, la válvula de la entrada de fase móvil se cierra y la de la salida se abre, provocando la salida de la fase móvil.

Una parte que también es importante y no hay que pasar por alto es la junta de cierre de la bomba, esta es la encargada de hacer que el fluido quede dentro de la bomba y no haya pérdidas. Debe de ser de un material adecuado a la fase móvil que se esté utilizando, por el contrario podría deteriorarse y dejar de llevar a cabo su función correctamente.

Inyector

Esta pieza es la encargada de introducir la muestra al sistema, a lo que se llama inyector realmente es una válvula de 6 vías, la cual tiene dos posiciones: la posición de carga de la muestra y la de inyección de esta. El funcionamiento se muestra en el siguiente esquema:

Posición de carga de la muestra: En esta posición la jeringa con la muestra llena el bucle completamente y la fase móvil está entrando directamente de la bomba a la columna.

Posición de inyección de la muestra: El bucle de muestra queda insertado en el circuito, entre la bomba y la columna, haciendo que la fase móvil arrastre la muestra dentro del sistema. 

La gran ventaja de este modo de inyección es que el volumen de muestra que se inyecta es siempre la misma y corresponde con el volumen el bucle. Cuando se introduce más volumen de muestra de la que el bucle puede retener, este exceso pasa directamente al desecho. Por lo general, es habitual que se inyecte un poco más de lo que el bucle es capaz de almacenar para asegurar el arrastre de toda la fase móvil o restos de otras muestras que hayan podido quedar dentro.




Columna

En este elemento del circuito es donde se lleva a cabo la separación de los analitos, físicamente, una columna de HPLC es un tubo de acero inoxidable con un diámetro interno uniforme y dentro del cual se encuentra la fase estacionaria.

En el interior de la columna, existe lo que llamamos macroporos y los mesoporos. Los macroporos es el espacio que deja sin cubrir el relleno de la columna y forman canales a través de los cuales fluye la fase móvil. Los mesoporos son las grietas en las partículas que componen el relleno que están en contacto con los macroporos, estos ayudan a aumentar el área superficial.

Con el paso de los años, se han ido introduciendo mejoras en este tipo de columnas que han permitido una mayor eficacia y velocidad de separación además de mayor estabilidad y reproducibilidad en los ensayos. También se han desarrollado nuevas fases estacionarias que han permitido que algunos tipos de muestras, los cuales antes no era posible analizar por cromatografía líquida, ahora sí lo sean. En la actualidad se pueden encontrar columnas para resolver casi cualquier tipo de problema analítico.

Tipos de rellenos de la columna

Existen numerosas marcas comerciales y a su vez numerosos tipos de materiales para los rellenos (algunos de ellos incluso sujetos a patentes). Pero por lo general podemos clasificar los rellenos en empaquetamientos de partículas porosas y los empaquetamientos peliculares:

  • Partículas porosas: constituidas por material de sílice, poliestireno-DVB o resinas de intercambio iónico. 
  • Empaquetamiento pelicular: son pequeñas esferas de vidrio o de polímero (no porosas), en cuya superficie se deposita una capa delgada de los materiales comentados en el apartado de arriba. 

Preguntas frecuentes sobre las columnas de HPLC

Referente al estudio de las columnas empleadas en HPLC existen una serie de preguntas que no queremos dejar sin aclarar:

  • ¿Qué es el tamaño de partícula?: En HPLC se llama tamaño de partículas al diámetro medio de las partículas que conforman el empaquetado de la columna.
  • ¿Qué es el tamaño de poro?: Las fases estacionarias que se utilizan por lo general son porosas, lo que hace que tengan una mayor superficie de contacto. El tamaño de poro se llama a la media del tamaño de los poros que tienen las partículas que componen el empaquetamiento de la columna. 
  • ¿Por qué la sílice es el soporte más común en las columnas de HPLC?: Esto se debe a que este compuesto (SiO2) tiene unas características que son especialmente buenas para una columna en HPLC, por ejemplo, puede soportar presiones elevadas, es estable y compatible con la mayoría de disolventes que se usan como fase móvil (tanto orgánicos como inorgánicos) además de tener una gran resistencia a los cambios de pH.
  • ¿Es mejor un empaquetamiento irregular o uno de forma esférica?: Cada empaquetamiento aporta una serie de ventajas frente al otro y debemos utilizar el que se adapte mejor a nuestro caso, por lo general, los empaquetamientos irregulares se utilizan más en cromatografía preparativa, es decir para preparar la muestra para una análisis posterior ya que tienen una elevada área superficial y bajo coste. Por otro lado, el empaquetamiento esférico proporciona una mayor eficacia, mejor estabilidad de la columna y la caída de presión en la columna es menor.




Detector

Esta parte del HPLC es lo que lo convierte en un instrumento analítico, es decir, la parte que permite obtener la información de la muestra en estudio. En este tipo de cromatografía, los detectores que se utilizan son de dos clases, los que se basan en una propiedad de la fase móvil que cambia cuando hay presencia de analitos y los detectores basados en un propiedad de la muestra. 

Los detectores funcionan de una manera relativamente sencilla: continuamente miden una propiedad  (varía dependiendo del tipo de detector), que en presencia de un analito varía, y es lo que utilizamos para razonar la presencia o la cantidad de este la muestra.

A medida que se va llevando a cabo el análisis, el detector va enviando los datos obtenidos a un ordenador que los recoge. Una vez que el análisis ha terminado, el ordenador representa los datos que hemos obtenido, por lo general, la señal recogida en el eje Y y el tiempo transcurrido en el X. A esta representación se le llama cromatograma.




Cromatografía HPLC en fase normal

Este fue el modo de funcionamiento original de los primeros HPLCs comercializados, en él la fase estacionaria es más polar que la fase móvil. Aunque por lo general ya este tipo de fases fue quedando en desuso con la aparición de la fase reversa, sí es interesante usarla cuando el compuesto de interés es muy polar. 

Cromatografía HPLC en fase reversa

La fase reversa (o invertida, o inversa) debe su nombre a que, al contrario de la fase normal, la fase móvil es más polar que la estacionaria. Es la modalidad de HPLC más usada actualmente, ya que los resultados en cuanto a separación de analitos y reproducibilidad del ensayo son mejores, además la columna utilizada en HPLC es más robusta y se estropean con menos frecuencia.

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